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      公司新聞

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      淀粉酶活性的測定
      時間:2023-08-14
      一、目的要求
      了解果蔬組織中淀粉酶的特點,學習淀粉酶活性的測定原理和方法。
      二、基本原理
      果蔬組織中的淀粉可在淀粉酶作用下轉化形成還原糖。淀粉酶對淀粉的分解作用是生物體利用淀粉進行碳水化合物代謝的初級反應。
      淀粉酶(Amylase)包括幾種催化特點不同的成員,它們廣泛存在于動物、植物和微生物界。幾乎所有植物中都存在有淀粉酶,特別是萌發后的禾谷類種子淀粉酶活性z強。不同來源的淀粉酶,性質有所不同。重要的淀粉酶主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶等。其中,α-淀粉酶隨機地作用于淀粉的非還原端,即作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分α-1,4-糖苷鍵,生成麥芽糖、麥芽三糖、寡聚葡萄糖、α-j限糊精等還原糖,同時使淀粉漿的粘度下降,因此又稱為液化酶。α-淀粉酶比較耐熱但不耐酸,在pH3.6以下迅速鈍化。Ca2+卻能使α-淀粉酶活化和穩定。β-淀粉酶從淀粉的非還原端作用于α-1,4-糖苷鍵,每次切下一分子麥芽糖,遇到支鏈淀粉的α-1,6-糖苷鍵時停止,生成β-j限糊精。β-淀粉酶又被稱為糖化酶,它是一種巰基酶,不需要Ca2+及Cl-等輔助因子。與α-淀粉酶相反,β-淀粉酶不耐熱但卻耐酸,在70 ℃保溫15 min可使其鈍化。根據它們的這種特性,鈍化其中之一,就可測出另一個的活性。葡萄糖淀粉酶則從淀粉的非還原端每次切下一個葡萄糖。
      淀粉酶催化產生的還原糖能使3,5-二硝基水楊酸還原,生成棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。淀粉酶活性的大小與生成的還原糖的量成正比。因此,可以用麥芽糖制作標準曲線,用比色法測定淀粉水解生成的還原糖的量,以單位重量樣品在一定時間內生成的還原糖的量表示酶活性。通常提取液中α-淀粉酶和β-淀粉酶同時存在。本實驗中先測定(α+β)淀粉酶總活性,然后在70 ℃加熱15 min,鈍化β-淀粉酶,測出α-淀粉酶活性。再與總活性(α+β)相比較,求出β-淀粉酶的活性。
      三、材料、儀器及試劑
      (一)材料
      馬鈴薯、香蕉、芒果等。
      (二)儀器及用具
      電子天平、分光光度計、離心機、恒溫水浴鍋(40 ℃、70 ℃、100 ℃)、具塞刻度試管(20 mL)、移液器或刻度吸管、容量瓶、研缽、離心管、試管。
      (三)試劑
      1.標準麥芽糖溶液(1 mg/mL)
      j確稱取100 mg麥芽糖,用蒸餾水溶解并定容至100 mL。
      2.3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑
      (1)配制500 mL含有185 g酒石酸鉀鈉的熱水溶液;
      (2)配制262 mL 的2 mol/L NaOH溶液;
      (3)稱取6.3 g的3,5-二硝基水楊酸;
      (4)稱取5.0 g結晶酚;
      (5)稱取5.0 g亞硫酸鈉;
      (6)將(2)、(3)、(4)、(5)各成分加入到(1)中,攪拌,使之溶解。待冷卻后,轉入到1 000 mL容量瓶中,并用蒸餾水定容至刻度,貯于棕色瓶中備用。蓋緊瓶塞,勿使CO2 進入。若溶液混濁可過濾后使用。
      3.100 mmol/L、pH 5.6的檸檬酸緩沖液
      母液A(200 mmol/L檸檬酸):稱取42.03 g C6H8O7·H2O2,用蒸餾水溶解、定容至1 000 mL。
      母液B(200 mmol/L檸檬酸鈉):稱取58.82 g Na3C6H5O7·2H2O2,用蒸餾水溶解、定容至1 000 mL。
      取27.5mL 母液A與72.5 mL 母液B,混勻,調節pH至5.6,用蒸餾水稀釋至200 mL,即為100 mmol/L、pH 5.6的檸檬酸緩沖液。
      4.1%淀粉溶液

      稱取1 g可溶性淀粉溶于100 mL 100 mmol/L、pH5.6的檸檬酸緩沖液中。


      四、實驗步驟
      (一)麥芽糖標準曲線的制作
      取7支具塞刻度試管,編號,按表13加入試劑。搖勻,置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水冷卻,加蒸餾水至20 mL。以0號管作為空白調零,在波長540 nm處比色測定。以麥芽糖含量為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線,求得線性回歸方程。
      表13.淀粉酶活性測定繪制麥芽糖標準曲線的各試劑加入量
      (二)酶液制備
      稱取10.0 g果蔬組織樣品,置于研缽中,加10 mL蒸餾水,研磨成勻漿后轉入離心管中,混合,在室溫(20 ℃)下放置提取20 min,每隔數分鐘搖動一次。然后于8 000 rpm離心20 min,收集上清液,轉入50 mL容量瓶中,加蒸餾水定容至刻度,搖勻,即為淀粉酶提取液,用于α-淀粉酶活性和淀粉酶總活性的測定。
      (三)活性測定
      取6支具塞刻度試管,編號,按表14進行操作。
      表14.淀粉酶活性測定過程
      加入DNS試劑后,搖勻各試管,置沸水浴中煮沸5 min,取出后迅速冷卻,加蒸餾水至20 mL,搖勻。按照與制作標準曲線相同的方法,在540 nm波長下比色,記錄測定結果。
      五、實驗結果與計算
      1.將測定的數據填入下表
      2.計算結果
      用I-2、I-3吸光度平均值與I-1吸光度值之差,II-2、II-3吸光度平均值與II-1吸光度值之差,分別在標準曲線上查出相應的麥芽糖量(mg),計算α-淀粉酶的活性和淀粉酶總活性,然后再計算出β-淀粉酶活性。淀粉酶活性以每分鐘每克鮮重果蔬樣品中酶催化作用下產生麥芽糖毫克數表示,即mg·min-1·g-1 FW。
      β-淀粉酶活性 (mg·min-1·g-1 FW) = 淀粉酶總活性-α-淀粉酶活性
      式中:
      Cα——查標準曲線求得α-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量,mg;
      CT——查標準曲線求得(α+β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量,mg;
      V——淀粉酶提取液體積(α-淀粉酶為50 mL),mL;
      VⅠ——測定α-淀粉酶時吸取酶提取液的體積,mL;
      VⅡ——測定總(α+β)淀粉酶時吸取酶提取液的體積,mL;
      t ——酶作用反應時間,min;
      W ——樣品重量,g。
      六、注意事項
      1.測定淀粉酶總活性時有時需要稀釋。樣品提取液的定容體積和酶液稀釋倍數可根據不同材料酶活性的大小而定。
      2.DNS試劑是強堿性試劑,在淀粉原酶液和稀釋液中分別先加入DNS試劑(I-1、II-1號試管),可以鈍化酶活性,作為空白對照。
      3.為了確保酶促反應時間的準確性,在進行保溫這一步驟時,可以將各試管每隔一定時間依次放入恒溫水浴,準確記錄時間,到達5min 時取出試管,立即加入3,5-二硝基水楊酸以終止酶反應,以便盡量減小因各試管保溫時間不同而引起的誤差。
      4.同時恒溫水浴溫度變化應不超過±0.5℃。酶反應需要適當的溫度,只有在一定的溫度條件下才表現出z大活性,40℃是淀粉酶的z適溫度,所以應將酶液和底物(淀粉液)先分別保溫至z適溫度,然后進行酶反應,這樣才能使測得的數據更加準確。
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